原代細胞分離培養有哪些注意事項?
1、組織塊培養法
(1)接種后的前3天,觀察和移動時注意不要引起液體振蕩。避免頻繁的翻倒和振動,否則組織塊不易附著在瓶壁上或附著后脫落飄浮。
(2)加入的培養基不宜過多,以免浸泡的組織因輕微波動而脫落。
(3)細胞向外遷移時,注意記錄并清除漂浮的組織塊和殘留細胞。它們產生的有毒物質會影響原代細胞的生長。
(4)為促進組織塊盡快貼在培養瓶上,可在種植前在培養瓶底壁涂上一層薄薄的膠原蛋白。
2、貼壁原代細胞
(1)原代細胞分離培養的分離細胞一次接觸體外環境時,會相互影響。這些細胞之間可以產生一些促生長活性物質,促進細胞的存活和生長。如果接種細胞的密度過低,細胞間的促生長作用就很小,細胞分散后很難適應從體內組織環境到獨立生存環境的變化過程。如果接種的細胞密度過高,會導致營養供給不足,代謝廢物迅速堆積,需要頻繁換液和通過。
(2)適當提高原代培養接種的細胞密度,為培養細胞提供更多與體內相似的細胞間相互作用,將大大提高原代培養細胞在體外的存活率。當細胞適應體外環境后進行傳代培養時,以較低的密度進行接種和培養。
(3)接種后的細胞盡快貼壁是培養成功的關鍵。接種后可將培養瓶放入培養箱中培養3h~5h。待細胞貼壁后,可補充培養基繼續培養。
3、懸浮型原代細胞
(1)原代細胞分離培養細胞必須保持懸浮狀態。可以通過增加培養基的粘度來懸浮細胞,例如在培養基中加入低濃度的透明質酸復合物。將培養基加入帶攪拌裝置的培養容器中,最少5ml,否則攪拌時會產生氣泡,對細胞造成損傷。這種方式要注意攪拌速度不要太快,否則培養基會溢出,容易造成污染。如果培養基的量小于5ml,可以使用旋轉瓶進行培養。更換懸浮培養細胞溶液時,注意不要吸出細胞。
(2)可懸浮培養的細胞一般活力強,體外分裂增殖快,營養物質消耗大,換液時間間隔短。