1. 將新生24h的SD大鼠用75%乙醇浸泡5min,開胸,取出心臟后于含有雙抗的預(yù)冷過的D-HANKS中漂洗兩遍,移入超凈臺。
2. 仔細剪除大血管,左右心房及右心室和室間隔,保留左心室,去除內(nèi)、外膜,PBS清洗。
3. 用眼科剪將心室肌剪碎至約1mm3,滴加1ml胎牛血清,均勻接種于6cm細胞培養(yǎng)皿內(nèi),組織塊間隔1-2mm,放入5% CO2,37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
4. 4小時后去除培養(yǎng)皿,加入3ml含有20%FBS和1%雙抗的H-DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)。
5. 一般情況下48小時后可見有細胞爬出,換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
6. 5-7天后有大量細胞鋪滿皿底,棄去培養(yǎng)基,用PBS清洗一遍,加入2ml胰酶進行消化1分鐘左右。
7. 吸去胰酶。加入*培養(yǎng)基終止反應(yīng),并用移液器反復(fù)吹打。
8. 傾斜培養(yǎng)皿稍等片刻,讓組織塊沉淀后吸去上層細胞懸液,70μm細胞篩過濾后接種至12孔板為后續(xù)共培養(yǎng)試驗做準(zhǔn)備。
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